Kijken naar HIV-knoppen van cellen: onderzoek toont de last-minute rol van eiwit met de naam ALIX

Anonim

Onderzoekers van de Universiteit van Utah bedachten een manier om te kijken naar nieuw vormende AIDS-virusdeeltjes die uit geïnfecteerde menselijke cellen opkomen of "ontluiken" zonder het proces te verstoren. De methode toont een eiwit genaamd ALIX raakt betrokken tijdens de laatste stadia van virusreplicatie, niet eerder, zoals eerder werd aangenomen.

"We kijken één cel tegelijk" en gebruiken een digitale camera en een speciale microscoop om films en foto's van het ontluikende proces te maken, zegt viroloog Saveez Saffarian, een assistent-professor in de fysica en astronomie en senior auteur van een nieuwe studie over HIV-ontluikende gepubliceerde online vandaag in het Public Library of Science-tijdschrift PLOS ONE.

"We zagen dat ALIX voor de eerste keer gerekruteerd werd voor HIV, " zegt hij. "Iedereen wist dat ALIX betrokken is bij het ontluiken van HIV, maar niemand kon de rekrutering van ALIX in het proces visualiseren."

De bevinding is "fundamentele basiswetenschap" en heeft geen onmiddellijke klinische betekenis voor AIDS-patiënten omdat ALIX betrokken is bij te veel kritische functies zoals celdeling als een waarschijnlijk doelwit voor nieuwe medicijnen, zegt Saffarian.

"We weten veel over de eiwitten die HIV helpen om uit de cel te komen, maar we weten niet hoe ze samenkomen om het virus te helpen ontsnappen, en het zal in de komende 10 tot 20 jaar zijn dat we veel zullen weten. meer over dit mechanisme, "voegt hij eraan toe. "Zou dit een medicijndoelwit zijn? Zou dit een onderdeel zijn van de biochemie die later in een therapeutische of biotechindustrie wordt gebruikt? Ik kan het u nu niet vertellen. Maar als het niet vanwege onze nieuwsgierigheid als soort was, zouden we niet hebben gehad de technologie die we vandaag hebben. "

De nieuwe studie "is leuk werk", zegt HIV-ontluikende deskundige Wes Sundquist, die Saffarian adviseerde en hoogleraar en co-voorzitter van biochemie is aan de University of Utah School of Medicine. "Het is van oprecht belang voor degenen onder ons die het mechanisme van HIV-assemblage bestuderen."

Het onderzoek werd gefinancierd door de National Science Foundation. Saffarian voerde het onderzoek uit met de eerste auteur, Pei-I Ku, een doctoraalstudent aan de Universiteit van Utah in de natuurkunde; Mourad Bendjennat, een postdoctoraal fellow in de natuurkunde en de astronomie; technicus Jeff Ballew; en Michael Landesman, een andere postdoctorale fellow in de natuurkunde en de astronomie die eerder in het biochemielaboratorium van Sundquist heeft gewerkt.

Kijk, niet aanraken, als HIV-knoppen

Biochemische methoden die jarenlang worden gebruikt, omvatten het verzamelen van miljoenen virussen in laboratoriumglaswerk en het doen van verschillende analyses om de eiwitten waaruit het virus bestaat te onthullen, bijvoorbeeld door antilichamen te gebruiken die binden aan bepaalde eiwitten en andere eiwitten te gebruiken die de eerste eiwitten doen fluoresceren, zodat ze kan gezien worden.

"Je doet het niet één virus tegelijk", zegt Saffarian. "Het probleem is dat je de verschillen tussen soortgelijke virussen niet ziet en je ziet niet de timing van hoe verschillende eiwitten komen en gaan om het virus uit de cel te helpen."

Andere methoden bevriezen of fixeren cellen op nieuwe HIV-deeltjes en gebruiken een elektronenmicroscoop om die stilstaande beelden van virale replicatie te fotograferen. Saffarian maakt ook gebruik van technologie die bekend staat als "totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie", die is gebruikt om te kijken naar dynamische processen in cellen.

De methode werd eerder gebruikt om beelden te maken van de ontluikende hiv en een vergelijkbaar paardenvirus, EIAV. Maar Saffarian zegt dat de studie niet aantoonde dat ALIX betrokken raakte bij het ontluiken van HIV en dat er fouten waren die er ten onrechte op wezen dat het ALIX-eiwit al vroeg in het EIAV-ontluikingsproces betrokken was, wat suggereert dat het hetzelfde deed bij het ontluiken van HIV.

Ku, Saffarian en collega's combineerden die microscopiemethode met een verbeterde manier om een ​​groen fluorescent "label" genetisch te koppelen aan ALIX-eiwitten in gekloonde cellen, zodat ze de eiwitten kunnen zien zonder hun normale functie te schaden. De onderzoekers probeerden verschillende zogenaamde "linkers" en vonden degene die hen de ALIX-eiwitten liet zien terwijl ze betrokken raakten bij het ontluiken van HIV, maar zonder het proces te verstoren.

Noch de microscooptechnologie, noch het labelen van eiwitten met groene fluorescentie zijn nieuw, maar "wat we deden is nieuw, we hebben deze fluorescente eiwitten gekoppeld aan ALIX met behulp van veel verschillende soorten linkers" om er een te vinden die het ALIX-eiwit goed laat werken, voegt hij eraan toe.

Het probleem met eerder onderzoek - dat aangaf dat ALIX vroeg betrokken was bij het ontluikende proces - was dat er slechts één linker werd gebruikt en dat het de normale functie van ALIX verminderde, zegt Saffarian.

Kijken naar eiwitten die hiv vormen

Wanneer HIV repliceert in een menselijke cel, maakt een eiwit met de naam Gag de meeste nieuwe deeltjes - er zijn 4.000 exemplaren van het Gag-eiwit in één HIV-deeltje - hoewel een aantal andere eiwitten bij het proces betrokken zijn, inclusief ALIX, dat staat voor "alg-2 interacting protein x." Experimenten zoals die van het team van Saffarian gebruiken 'virusachtige deeltjes'. Dit zijn HIV-deeltjes ontdaan van hun genetische blauwdruk of genoom, zodat ze geen infectierisico in het laboratorium vormen.

"Virusachtige deeltjes behouden dezelfde geometrie en hetzelfde ontluikende proces als infectueus HIV", zegt Saffarian.

Tijdens het ontkiemen verzamelen Gag-eiwitten zich aan de binnenkant van een celmembraan - samen met ALIX in de late stadia - en vormen een nieuw HIV-deeltje dat zich een weg uit de cel baant - het proces waardoor AIDS in een geïnfecteerde persoon zich van cel naar cel verspreidt. cel.

Om naar het ontluikende proces te kijken, plaatsen Ku, Saffarian en collega's menselijke HELA-cellen die de deeltjes bevatten in een kleine hoeveelheid vloeibaar groeimedium in een petrischaal en plaatsen deze onder de microscoop, die zich in een glazen kamer op lichaamstemperatuur bevindt, zodat de cellen kunnen langer dan 48 uur in leven blijven. Een blauwe laser in vaste toestand is gericht op het monster om de groen-gelabelde ALIX en rood gemerkte Gag-eiwitten te doen gloeien of fluoresceren, zodat ze kunnen worden gezien als ze worden samengevoegd tot een virusdeeltje.

Met rood-gelabelde Gag-eiwitten en groen-gelabelde ALIX-eiwitten, "konden we zien dat ALIX aan het einde van de assemblage van het virusdeeltje komt", waarbij ongeveer 100 ALIX-eiwitten samenkomen met de ongeveer 4.000 Gag-moleculen en worden samengevoegd tot een nieuw HIV-deeltje. ALIX brengt dan twee andere eiwitten binnen, die het ontluikende virusdeeltje uit de cel verwijderen wanneer het naar buiten komt. De positie van ALIX tijdens het afknijpen van nieuwe deeltjes was nog niet eerder herkend, zegt Saffarian

De onderzoekers keken toe hoe de virusdeeltjes in één cel per keer ontluiken: gewoonlijk kwamen er ongeveer 100 tevoorschijn gedurende een periode van twee uur. Saffarian zegt dat de meeste ALIX-eiwitten achterbleven toen de HIV-assemblage voltooid was en terug in de vloeistof in een cel werd teruggezet.

Hij zegt dat de ontdekking dat ALIX pas meedoet nadat de laatste stadia van het ontluiken van HIV het bestaan ​​suggereert van een voorheen onbekend mechanisme in het virus dat de timing reguleert van ALIX en andere eiwitten bij het samenstellen van nieuwe HIV-deeltjes.

"We ontdekten dat de cellulaire componenten die helpen bij de vrijlating van het virus eigenlijk in een veel complexer timingschema terechtkomen dan voorspeld op basis van de biochemische gegevens, " zegt Saffarian. "De uitkomst van deze studie is veelbelovend omdat het een nieuw reguleringsmechanisme blootlegt voor de rekrutering van cellulaire componenten naar de hiv-ontluikende locaties en de deur opent voor spannende toekomstige studies over het mechanisme van HIV-ontluiking."

Natuurkundigen in de Virologie

Waarom bestuderen natuurkundigen virussen? Ten eerste bestuderen biofysici fysische mechanismen in de biologie, zoals motoren in cellen. Saffarian verdiende een doctoraat in de biofysica, het ontwikkelen van methoden die fluorescente licht gebruikt om te kijken naar cellulaire processen.

"Ik werd heel jaloers omdat ik me elke keer voelde dat ik een bijdrage leverde aan een project, de wetenschap feitelijk iemand anders achtervolgde", zegt hij. "Ik hielp hen met tools, maar stelde zelf geen fundamentele vragen."

Dus Saffarian volgde een postdoctorale fellowship in de celbiologie aan de Harvard Medical School, "besloot toen dat ik virussen wilde bestuderen, hoe ze uit cellen zouden komen en repliceren." Naast zijn positie in de natuurkunde is hij adjunct-assistent-professor in de biologie.